一项新的大规模研究表明，X射线晶体学可以用于寻找可以重新用于靶向SARS-CoV-2主要蛋白酶的药物。除了鉴定出37种潜在的候选药物外，这项于4月2日在《科学》杂志上发表的研究还揭示了SARS-CoV-2主要蛋白酶上可以与药物结合的新结合位点。
SARS-CoV-2多蛋白的蛋白水解切割主要由主要蛋白酶完成。该酶包含一个胰凝乳蛋白酶样折叠，并带有一个C末端螺旋结构域，并且在其活性位点包含一个由Cys145和His41组成的催化二聚体，该二聚体由四个主要口袋组成。活性位点位于单体三结构域结构的两个N-末端结构域之间的缝隙中，而C-末端螺旋结构域参与酶的调节和二聚化。
主要蛋白酶是抗病毒药物发现和化合物筛选的靶标，因为它参与了病毒复制。在这项新研究中，来自德国国家电子研究中心(DESY)的研究人员试图确定可能对主要蛋白酶有效的重新用途的候选药物，该研究中心运行用于结构生物学实验的粒子加速器。
DESY团队对两个药物库进行了高通量X射线晶体学筛选，以发现可用于抗SARS-CoV-2主要蛋白酶的候选药物。使用PETRA III(DESY的高亮度X射线光源设备)上的P11高通量结晶学线，以原子分辨率对与药物库中化合物混合的主要蛋白酶的共晶体成像。
总共从弗劳恩霍夫转化医学与药理学研究所的弗劳恩霍夫IME重用集合和意大利公司DompéFarmaceutici的“人中安全”文库中筛选了5,953种独特的化合物。与许多晶体学片段筛选实验相反，这些药物库包含完整的化学复杂化合物。该化合物已经在临床试验中测试了生物活性和细胞通透性。
PETRA III工作站P11包括使用机械臂进行的全自动样品更换，因此7,000多次测量中的每一次仅花费了大约三分钟。使用这种高通量技术，该团队能够迅速将目标化合物与无潜在活性的化合物分离。
测量站P11处的样品架(左)在来自PETRA III加速器的X射线光下旋转样品。同时，一股冷氮气流冷却了样品。借助许多来自不同方向的散射图像，可以计算出蛋白质-药物复合物的分子结构。图片由DESY / C / Schmid提供。
研究人员从X射线衍射数据集中获得了2,381种独特的化合物，然后对其进行了自动结构细化，聚类分析和泛数据集密度分析(PanDDA)。他们从3D蛋白质结构中鉴定出与主要蛋白酶结合的37种化合物。
“与其他筛查方法相比，我们的X射线筛查方法的特别优势在于，我们可以获得蛋白质-药物复合物的三维结构，因此可以从原子上鉴定药物与蛋白质的结合级”，DESY博士后研究员Patrick Reinke博士解释说。“即使两个最有前途的候选者都没有进入临床试验，与主要蛋白酶结合的37种物质也构成了基于它们的有价值的数据库，用于药物开发。”
大多数化合物都结合在主要蛋白酶的活性位点上。八个在活性位点内共价结合，另外八个在活性位点内非共价结合。十三种化合物在各个位置的活性位点外部结合。
为了进一步探索化合物的适用性，进行了基于细胞的病毒还原试验以评估抗病毒活性。研究人员确定了总共7种化合物-一种拟肽化合物和6种非肽化合物-表现出至少100倍的病毒颗粒减少，且具有良好的选择性指数(该比率可衡量细胞毒性和抗病毒活性之间的窗口)。七个化合物是AT7519，钙蛋白酶，伊芬地尔，MUT056399，培利替尼，托哌酮和三缩水甘油基异氰脲酸酯。
第一作者和DESY博士后研究员SebastianGünther博士解释说：“活性物质Calpeptin和Pelitinib显然显示出最高的抗病毒活性，并且具有良好的细胞相容性。因此，我们的合作伙伴已经开始对这两种物质进行临床前研究。”
意外的启示
在对全部药物化合物进行分析的过程中，研究人员发现了一些出乎意料的东西-主要蛋白酶上的结合位点，这是完全未知的。在C端二聚结构域的疏水口袋中发现了此变构位点，该位置靠近穗蛋白的S1结合位点。该小组的筛选和基于细胞的试验表明，pelitinib通过在该位点结合具有抗病毒抑制的潜力。此外，在所有人类冠状病毒主要蛋白酶中，该结合位点中残基的疏水性均是保守的。
“我们能够在主要蛋白酶上发现一个新的药物结合位点，这不仅是一个令人惊讶的惊喜，这一结果实际上只能在像PETRA III这样的同步加速器光源下才能实现，而且，即使是两者之一有希望的候选药物正好与该位点结合。”汉堡大学的合著者克里斯蒂安·贝泽尔(Christian Betzel)博士说。
他们还确定了第二个变构位点，该位点是由催化结构域和二聚化结构域之间的深槽形成的。虽然AT7519是筛选物中唯一与该位点结合的化合物，但活性中等，但科学家认为，该位点可能是通过调节Arg298(一个对酶二聚化至关重要的残基)而成为的新靶标。
DESY理事会主席Helmut Dosch博士强调：“ PETRA III的调查令人印象深刻，显示了高亮度同步加速器光源与未来药物的开发以及整个健康研究的相关性。” “我们必须并且希望将来进一步扩展我们的基础设施，以应对当前的健康危机。”
