出版源：《食品科学》2016年37卷18期
刊出日期：2016-09-25
作者：程述震，张春晖，张洁，解新方，王志东
作者单位：中国农业科学院农产品加工研究所
摘要：
为探究电子束辐照对充氮包装冷鲜牛肉品质的影响,取6头黄牛背最长肌,在高能电子加速器下辐照,4℃贮藏,评估不同辐照剂量和贮藏时间条件下微生物学、生物化学和感官特性的变化。辐照处理组和对照组相比,菌落总数显著下降;电子束辐照对牛肉样的贮藏损失、色泽、pH值、脂肪氧化并未产生显著性的影响,对TVB-N值的影响较小;感官评价分析发现,随着辐照剂量的增加，色泽、气味、接受性得分下降。综合分析各品质指标,2.5 kGy左右的低剂量电子束辐照可以在杀灭微生物的同时,较好地确保牛肉品质,提高冷鲜牛肉的货架期。是一种较为理想的鲜牛肉保质技术。
近年来，我国肉品种类和需求大幅增加，肉品工业呈现蓬勃发展之势 [1-3]。目前，我国生肉市场主要存在热鲜肉、冷鲜肉和冷冻肉3 种形式。与热鲜肉、冷冻肉相比，冷鲜肉具有质地柔软、营养价值高、汁液损失少等优点，因此越来越多地受到消费者的青睐 [4]。但在牲畜屠宰、胴体分割及肉品加工过程中，肉品极易受到微生物的污染，而引起食源性疾病。虽然在整个生产流通环节，冷鲜肉始终处于低温环境，一定程度上控制了微生物的生长，但一些耐冷性微生物，如沙门氏菌和李斯特菌等，依然能够正常的生长繁殖，危害肉品品质和安全，使其货架期缩短，引发食物中毒等问题。
目前，主要的杀菌方式包括腌渍、冷冻、高压，气调包装等，而可应用冷鲜肉的杀菌方式较少。食品辐照作为一种物理杀菌方式，可有效杀灭微生物，而不引起物料温度的升高，因此被称之为“冷杀菌”技术，在全世界多个国家的多种产品中被应用。用于食品辐照的射线类型主要包括高能电子加速器产生电子束 和60Co 或者137Cs产生的γ射线，两种射线在肉品保藏中均有应用，但现有研究表明，在相同辐照剂量条件下，具有还原性的电子束和γ射线相比，引起的肉品氧化效应较小 [5]。因此，近年来电子束辐照在肉品中的研究和应用越来越多。
本实验将电子束辐照技术与充氮包装相结合，在杀灭微生物的同时，确保冷鲜肉的品质不会受到显著性的影响，以解决冷鲜肉货架期短的问题，为电子束辐照在冷鲜牛肉保鲜贮藏过程的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冷鲜牛肉背最长肌(外脊) 北京市卓宸畜牧有限公司。
丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyl anisd，BHA)、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA) 美国Aladdin ®公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA) 国药集团化学试剂有限公司。实验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BS224S-电子天平 德国Sartorius公司;ET-90-气调包装机 中国Super Sealer公司;FYL-YS-12低温保存箱北京福意联电器有限公司;FZ-10/15型高能电子加速器 中国原子能科学研究院;YM-50立式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司;BILON-09-无菌均质器上海比朗仪器制造有限公司;HWS智能型恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂;SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限责任公司;QL901涡旋混匀器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱 北京陆希科技有限公司;DIGIEYE数码测色系统英国Verivide公司;T25-分散器 德国IKA ®公司;FE-20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SIGMA-离心机 北京五洲东方科技发展有限公司;T6-新世纪紫外-可见分光光度计 中国普析公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
肉用黄牛经卓宸畜牧有限公司商业化屠宰，4 ℃条件冷却排酸3 d，取6 条冷鲜牛肉背最长肌，剔除可视脂肪、筋膜和筋键切成长宽厚为5 cm×4 cm×1 cm的肉片以确保辐照的均一性。记录每份样品的质量，100% N 2包装，置于4 ℃低温冰箱中待第2天辐照。
1.3.2 辐照处理
样品于北京原子高科股份有限公司辐照，电子加速器能量为10 MeV，设定辐照参数为：辐照剂量1.5、2.5、3.5 kGy，剂量率150 kGy/min，辐照温度0～4 ℃(样品放置于碎冰之上)，每个剂量跟踪3 支剂量计。样品最终辐照剂量分别为：1.241、2.300、3.429 kGy。辐照后置于4 ℃冰箱贮藏。
1.3.3 菌落总数测定
根据GB/T 4789.2—2010 《食品微生物学检验：菌落总数测定》方法操作。取25 g样品加入225 mL无菌生理盐水于无菌均质袋内，用拍打式均质器拍打2 min，制成1∶10样品匀液。用1 mL微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中，振摇试管，制成1∶100的样品匀液。重复以上步骤，制备10 倍系列稀释样品匀液。选择2～3 个适宜稀释度的样品匀液，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做2 个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入2 个无菌平皿内作空白对照。将15～20 mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，(36±1)℃培养(48±2)h。培养完成后记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。
1.3.4 汁液贮藏损失率
参考Davis等 [6]的方法稍作修改。充氮包装前测定的样品质量，去除包装材料，将样品表面的水分擦干后称量其质量。汁液贮藏损失率按以下公式计算：
式中：m 1为充氮包装前样品质量/g;m 2为每个贮藏阶段的样品质量/g。
1.3.5 冷鲜肉感官评定
6 名感官评定人员对样品的色泽、气味和可接受性(综合样品色泽和气味对样品进行的总体打分)3 项指标进行感官评定。评分标准参考肖虹等 [7]方法并稍作修改，评分采用5 分制，具体的评分标准如表1所示。
表1 电子束辐照冷鲜牛肉感官评定标准
Table1 Criteria for sensory evaluation of chilled beef irradiated with electron beam
分值感官评定指标色泽气味可接受性5色泽鲜红，有光泽鲜牛肉特有气味，无异味感官效果很好，愿意接受4色泽较鲜红，有光泽牛肉气味淡，稍有辐照味感官效果较好，可以接受3色泽暗红，无光泽无牛肉气味，辐照味大感官效果一般，基本接受2色泽灰暗或苍白，无光泽轻微腐败味感官效果较差，勉强接受1色泽暗褐色严重腐烂味感官效果很差，无法接受
1.3.6 色泽测定
用DIGIEYE数码测色系统(电子眼)对样品的表面色泽进行测定，每组处理放在同一样品盘中进行测定。不规则选取整个样品，记录每个样品的平均L*、a*值，每个样品测定3 次，取其平均值。
1.3.7 pH值测定
参考Kim等 [8]的方法测定样品pH值。取样品10 g，置于均质杯中，加入50 mL去离子蒸馏水，用T-25分散器8 000 r/min均质1 min，单层中性滤纸过滤，用pH计测定滤液pH值。
1.3.8 挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)值测定
TVB-N值按照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中的半微量定氮法测定。
1.3.9 硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)值测定
脂肪氧化的测定参考Nam等 [9]方法，取5 g样品于50 mL的离心管中，加入15mL去离子蒸馏水后用分散机12 000 r/min均质10s，取1 mL匀浆液于玻璃试管(13 mm×100 mm)中，加入50 μL 7.2%的BHA和2 mL的TBA-TCA混合液(含20 mmol/L TBA和15% TCA)，漩涡混匀，90 ℃水浴保温15 min，取出于冷水中冷却10 min，漩涡混匀，离心15 min(3 000×g)，取上清液在532 nm波长处比色，空白对照为1 mL去离子蒸馏水和2 mL TBA-TCA混合液。TBARS值表示为每千克冷鲜牛肉中含有的丙二醛毫克数。
1.4 数据分析
实验数据采用SPSS 19.0软件进行分析，采用Origin 7.5软件进行作图。各项指标重复3 次，取其平均值。
2 结果与分析
2.1 电子束辐照对冷鲜牛肉菌落总数的影响
图1 不同辐照剂量条件下冷鲜牛肉贮藏期间菌落总数的变化
Fig.1 Changes in TBC value of irradiated beef during storage periods
肉中内源性酶和微生物是引起冷鲜肉货架期短、贮藏期间品质劣变的主要因素，而微生物的生长代谢所引起的肉品腐败更大 [10]。国家一级冷鲜肉细菌总数低于10 4CFU/g，细菌总数超过10 6CFU/g时冷鲜肉变质，细菌总数达到10 7CFU/g时冷却肉外观开始出现明显腐败现象，细菌总数超过10 8CFU/g时冷却肉外表有黏液形成，则不宜食用 [7]。
从图1可以看出，在28 d的贮藏期间辐照组相比于对照组菌落总数显著性(P<0.05)降低，且辐照剂量越大，菌落总数越低。在贮藏第0天(辐照后第1天)时，与对照组相比，处理组的菌落总数分别下降了0.766、1.801、2.673(lg(CFU/g))，差异显著(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，冷鲜肉的微生物总数增加，对照组在冷藏第14天时菌落总数达到6.207(lg(CFU/g))，超过国家标准(10 6CFU/g)，未经包装处理的冷鲜肉的货架期在5～7 d左右，充氮包装在一定程度上也抑制了微生物的生长;1.5、2.5、3.5 kGy辐照处理组的菌落总数在分别第19、25、28天达到7.202、6.825、6.570(lg(CFU/g))，超出国家标准(10 6CFU/g)。
综上可见，辐照的剂量越大，对冷鲜肉中微生物的杀灭效果越好，与其他研究 [11-14]的结果一致。原因在于辐照剂量越大，微生物细胞内部DNA损伤越大，导致无法修复而影响微生物的正常生长和繁殖，从而达到了杀菌的效果。当样品菌落总数超过国家标准，其他指标不再测定。
2.2 电子束辐照对冷鲜牛肉汁液贮藏损失率的影响
图2 不同辐照剂量条件下冷鲜牛肉贮藏期间汁液流失的变化
Fig.2 Changes in purge loss of irradiated beef during storage periods
动物体的肌肉中水分含量在70%左右，宰后贮藏中会由于汁液流失而减少，使冷鲜肉的营养物质损失，降低了冷鲜肉的营养价值。由图2可见，辐照组与处理组相比，贮藏损失率有所增加，在贮藏第0天各处理组汁液贮藏损失率分别为增加0.24%、1.59%、0.09%，各组之间的差异不显著。随着贮藏时间的延长，辐照处理组和空白对照组的汁液贮藏损失率均有所增加，但是二者之间并无显著性差异。因此可见，虽然经过辐照处理的冷鲜牛肉汁液贮藏损失率有所增加，但增加并不显著，各个处理组之间也并无显著性差异，由此可知辐照处理并不会对冷鲜牛肉贮藏期间的汁液贮藏损失率有显著影响。
2.3 电子束辐照对冷鲜牛肉感官指标的影响
表2 电子束辐照冷鲜牛肉感官评定得分
Table2 Sensory evaluation results of chilled beef irradiated with electron beam
感官形态是评判冷鲜肉新鲜程度最直观的方式，同时也是影响消费者购买欲的重要方面。如表2所示，对照组和处理组在色泽及气味方面存在差异。经过辐照处理冷鲜肉的颜色变深，亮度下降，色泽得分降低，且随着辐照剂量的增加颜色更暗，得分更低;冷鲜肉经过辐照处理以后会产生一种特殊的“辐照味”，研究人员将这种“辐照味”描述为烤玉米味、烧焦味等 [15-17]，同时众多研究学者对于“辐照味”机理做了大量的研究，多数研究学者认为是冷鲜肉蛋白经过辐照发生分解产生的小分子醛酮物质引起，氧气的存在是产生辐照异味的主要因素[18](多种解决办法：绝氧环境下辐照、充入惰性气体N2或CO2等气凋包装、降低辐照时肉的温度至零度以下)，由表2可知，1.5 kGy和2.5 kGy处理组之间的差异不明显，而3.5 kGy处理组的气味得分更低，因此辐照剂量大到超出某个范围后，其辐照异味会加剧;在贮藏初期1.5、2.5 kGy处理组和对照组的可接受性得分较高，而3.5 kGy处理组感官接受性较差。随着贮藏时间的延长，处理组和对照组3 项指标得分均呈现下降趋势。因此从感官评价来看，1.5 kGy和2.5 kGy辐照处理可能更容易被消费者所接受。
2.4 电子束辐照对冷鲜牛肉色泽的影响
图3 不同辐照剂量条件下冷鲜牛肉L*值(A)和a*值(B)随贮藏时间的变化
Fig.3 Changes in color parameters (L* and a* values) in chilled beef irradiated with different doses of electron beam
色泽是食品的一种基本物性，是评价冷鲜肉品质的重要指标，影响消费者的购买欲 [19]。L*和a*是评价冷鲜肉品质的两个重要参数 [4]。由图3A可以看出，在贮藏初期辐照组的亮度值L*低于对照组，原因可能是在贮藏初期辐照处理组肌红蛋白氧化程度更大。随着贮藏时间的延长，不同剂量的处理组之间存在差异，2.5 kGy处理组的颜色较鲜艳。肌红蛋白(约占70%～80%)和血红蛋白(约占20%～30%)是影响肉品颜色的两大主要因素，肉的颜色主要取决于氧合肌红蛋白、肌红蛋白、高铁肌红蛋白之间的比例。还原型肌红蛋白本身是暗红色，与氧结合可生成鲜红的氧合肌红蛋白和褐色的高铁肌红蛋白。电子束辐照处理使冷鲜肉中自由基含量增加，肌红蛋白被氧化成高铁肌红蛋白使冷鲜肉颜色红度值a*降低(图3B)，与Kanatt等 [20]研究结果一致。
2.5 电子束辐照对冷鲜牛肉pH值的影响
图5 不同辐照剂量条件下冷鲜牛肉pH值随贮藏时间的变化
Fig.5 Changes in pH values in chilled beef irradiated with different doses of electron beam
理论上认为：新鲜肉pH 5.8～6.2，次鲜肉pH 6.3～6.6，变质肉pH 6.7以上 [10]。由图5可见，在贮藏第0天，对照组和处理组的pH值分别为5.56、5.59、5.58、5.60，差异不明显，说明电子束辐照处理对冷鲜肉的pH值没有显著性影响;随着贮藏时间的延长，在贮藏第7天时，对照组pH值为5.9，3 个处理组的pH值有所增加变为6.15、6.17和6.2，但是经过SPSS 19.0分析可知处理组和对照组之间无显著性差异，此时处理组和对照组状态良好，属于一级冷鲜肉;随着贮藏时间的延长，在微生物和内源酶的作用下，肉中的蛋白质被分解，使含氮物质增加，pH值升高，3.5 kGy处理组在贮藏第25天pH 6.68，属于次鲜肉范围。辐照处理使冷鲜肉pH值升高，但升高幅度不明显。
2.6 电子束辐照对冷鲜牛肉TBARS值的影响
图6 电子束辐照对冷鲜牛肉TBARS值影响
Fig.6 Effect of electron beam irradiation on the TBARS value of chilled beef
TBARS值是指动物性油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的衍生物主要是丙二醛与TBA反应的结果 [21]。TBARS值的高低表明脂肪二级氧化产物的多少，是最广泛的用于评价脂肪氧化程度的指标之一。如图6所示，在贮藏初期，电子束辐照使冷鲜牛肉脂肪中自由基含量增加，加快了脂肪的氧化速度，处理组TBARS值高于对照组，但在贮藏第0天差异不显著，各处理组的TBARS值分别为0.215、0.223、0.229 mg/kg，无显著性差异。许多研究 [22-23]报道辐照会加速肉及肉制品的氧化，而且氧化程度会与辐照剂量，包装形式和抗氧化剂有关。但本实验并未证明脂肪氧化程度与辐照剂量有显著性关系。随着贮藏时间的延长，对照组和处理组的TBARS值均增大，贮藏第7天对照组的脂肪氧化程度为0.269 mg/kg，低于3组处理(0.292、0.295、0.304 mg/kg)。随着辐照剂量的增加，贮藏时间的延长，冷鲜牛肉的脂肪氧化程度逐渐增加。
2.7 电子束辐照对冷鲜牛肉TVB-N值的影响
图7 电子束辐照对冷鲜牛肉TVB-N值影响
Fig.7 Effect of electron beam irradiation on the TVB-N value of chilled beef
冷鲜肉在贮藏过程中，由于细菌和酶的作用，会发生腐败使蛋白分解而产生氨及胺类等碱性含氮物质，此类物质具有挥发性 [7]，是判断冷鲜肉腐败品质变化的一个最为重要的指标之一 [4，7，10，24]。据GB/T 2707—2005规定冷鲜肉TVB-N值一级鲜度≤15.0 mg/100 g、二级鲜度≤25.0 mg/100 g、变质肉>25.0 mg/100 g。
从图7可以看出，随着贮藏时间的延长，对照组TVB-N值增加，但未超过15.0 mg/100g，推测原因是充氮包装抑制了微生物活动，蛋白质分解速度下降。辐照处理组在整个贮藏期间呈不规律性变化，在贮藏第0天，处理组的TVB-N值(6.63、7.07、7.30 mg/100g)均高于对照组(6.30 mg/100g)，原因是辐照处理加速了蛋白质的氧化，使蛋白分解产生氨及胺类等碱性含氮物质增加，但在贮藏第7天，1.5 kGy和2.5 kGy处理组TVB-N值均低于对照组(6.50 mg/100g)，3.5 kGy处理组(7.57 mg/100g)高于对照组。在贮藏期间辐照处理组TVB-N值均未超过国家规定的一级冷鲜肉15 mg/100g，该研究结果与Javanmard等 [25]一致，辐照可降低肉品中TVB-N值。
3 结 论
经电子束辐照后，冷鲜牛肉中的细菌总数显著性下降，辐照的剂量越高，杀菌效果越好。在贮藏期内，电子束辐照对冷鲜牛肉的贮藏损失、色泽、pH值、脂肪氧化并未产生显著性的影响，对TVB-N值的影响较小。感官评价中发现随着辐照剂量的增加，色泽、气味、接受性得分下降。结合以上各指标分析，建议牛肉在贮藏前可以用2.5 kGy左右的低剂量电子束辐照以提高冷鲜牛肉的货架期。
