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如何使用实时RT-PCR检测到COVID-19病毒?

2020-04-05 21:01          RT-PCR COVID-19
随着导致COVID-19病毒在世界范围内传播,国际原子能机构(IAEA)与联合国粮食及农业组织(FAO)合作,提供其支持和专业知识,以帮助各国使用实时逆转录聚合酶链反应(实时RT-PCR)检测,跟踪和研究冠状病毒的最准确的实验室方法。

但是什么是实时RT-PCR?它是如何工作的?它与核技术有什么关系?

什么是实时RT-PCR?

实时RT-PCR是一种核衍生方法,用于检测任何病原体(包括病毒)中特定遗传物质的存在。最初,该方法使用放射性同位素标记物检测目标遗传物质,但随后的提炼,同位素标记物却被特殊标记物(最常见的是荧光染料)取代。借助这种技术,科学家可以在过程仍在进行时几乎立即看到结果。常规RT-PCR仅在最后才能提供结果。

尽管实时RT-PCR是检测冠状病毒的最广泛使用的方法,但许多国家在建立和使用该技术时仍需要支持。

什么是病毒?什么是遗传物质?

病毒的遗传物质由一个分子被膜围绕的显微包。遗传物质可以是DNA或RNA。

DNA是在所有生物(例如动物,植物和病毒)中发现的两链分子,并且具有遗传密码,可说明这些生物如何形成和发展。

RNA通常是一种单链分子,可将部分遗传密码复制,转录并传递给蛋白质,因此它们可以合成并执行使生物体存活和发育的功能。RNA具有复制,转录和传输的不同变体。

某些病毒,例如冠状病毒(SARS-Cov2)仅包含RNA,这意味着它们依靠入侵的健康细胞来繁殖和存活。一旦进入细胞,该病毒就会利用其自身的遗传密码(在冠状病毒中为RNA)来控制细胞并对其进行“重新编程”,使其成为制造病毒的工厂。

为了使用实时RT-PCR在人体中早期检测到冠状病毒等病毒,科学家需要将RNA转化为DNA。这是一个称为“逆转录”的过程。他们之所以这样做,是因为复制或扩增DNA,这是实时RT-PCR检测病毒过程的关键部分。

科学家将转录的病毒DNA的特定部分放大数十万倍。扩增非常重要,因此科学家不必试图在数百万条遗传信息链中发现微量的病毒,而是拥有足够数量的病毒DNA靶标区域,以准确地确认该病毒的存在。

实时RT-PCR如何发现冠状病毒?

从冠状病毒聚集的身体部位(例如人的鼻子或喉咙)收集样品。用几种化学溶液处理样品,该溶液去除物质(例如蛋白质和脂肪),仅提取样品中存在的RNA。提取的RNA是人自身遗传物质和冠状病毒RNA(如果存在)的混合物。

使用特定的酶将RNA反转录为DNA。然后,科学家添加了额外的DNA短片段,这些片段与转录的病毒DNA的特定部分互补。如果样品中存在病毒,则这些片段会将自身附着到病毒DNA的靶标区域。一些添加的遗传片段用于在扩增过程中构建DNA链,而其他一些用于构建DNA并在这些链上添加标记物标记,然后将其用于检测病毒。

然后将混合物置于RT-PCR机器中。机器在加热和冷却混合物的温度之间循环,以触发特定的化学反应,从而产生病毒DNA靶标部分的新的相同副本。该循环反复重复以继续复制病毒DNA的靶标部分。每个循环将以前的数量加倍:两个副本变为四个,四个副本变为八个,依此类推。标准的实时RT-PCR设置通常需要经过35个循环,这意味着到该过程结束时,样品中存在的每条病毒链都会产生约350亿新的病毒DNA片段副本。

构建新的病毒DNA片段后,标记物标签会附着在DNA链上,然后释放出荧光染料,该荧光染料可以通过机器的计算机进行测量,并实时显示在屏幕上。在每个循环后,计算机都会跟踪样品中的荧光量。当该数量超过一定水平的荧光时,这确认该病毒存在。科学家还监视达到此水平所需的周期数,以估计感染的严重程度:周期越短,病毒感染越严重。

为什么要使用实时RT-PCR?

实时RT-PCR技术具有高度的敏感性和特异性,可以提供只需三个小时的可靠诊断,尽管通常实验室平均要花费6到8个小时。与其他可用的病毒分离方法相比,实时RT-PCR显着更快,并且污染或错误的可能性更低,因为整个过程都可以在封闭的试管中完成。它仍然是可用于检测冠状病毒的最准确方法。

检测过去的被感染者,这对于理解病毒的发展和传播很重要,不能使用实时RT-PCR,因为病毒仅在特定时间段内存在于体内。其他方法对于检测,跟踪和研究过去的感染也是必要的,尤其是那些可能已发展且没有症状的传播。

国际原子能机构与粮农组织合作,已经培训和装备了来自世界各地的专家,使用实时RT-PCR方法已有20多年了,特别是通过其VETLAB兽医诊断实验室网络。最近,该技术还被用于诊断其他疾病,例如埃博拉病毒,寨卡病毒,MERS-Cov,SARS-Cov1以及其他主要的人畜共患病和动物疾病。人畜共患病是也可以感染人类的​​动物疾病。



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