郑丹栅：利用64Cu/ 67Cu进行预靶向放射免疫治疗的治疗诊断方法

利用64Cu/ 67Cu进行预靶向放射免疫治疗的治疗诊断方法

摘要: 在过去的十年中，一体化诊疗已成为肿瘤学中一种强大的临床工具，用于筛选对靶向治疗有反应的患者并监测此类患者对治疗的反应。这篇文章报告了一种基于铜放射性同位素的预靶向放射免疫疗法(PRIT)的治疗诊断方法：发射正电子的铜-64(Cu-64, t1/2 = 12.7 h)和发射 β 粒子的铜-67(Cu-67，t1/2= 61.8 h)。该策略基于反式环辛烯(TCO)偶联抗体和四嗪(Tz)放射性配体之间通过快速生物正交逆电子需求Diels-Alder反应进行的体内连接。纵向治疗研究在人类结肠直肠癌的鼠模型中进行，使用TCO修饰的huA33抗体(huA33-TCO)和67Cu标记的Tz 放射性配体([67Cu]Cu-MeCOSar-Tz)的免疫偶联反应。在注射huA33-TCO 72h后注射[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，设置18.5、37.0或 55.5 MBq的注射剂量，并产生了依赖性治疗反应，中位生存时间从最低剂量的68天增加到最高剂量的>200天。此外，以分级方式(二次注射)接受最高剂量 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz的小鼠在不影响治疗效果的前提下，改善了血液的辐射副作用。单次施用huA33-TCO后分别注射[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz 和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz的双放射性核素实验表明，前者产生的正电子发射断层扫描图像准确预测后者的功效。在这些实验中，观察到[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz]的肿瘤摄取之间和随后对 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 的治疗反应存在相关性。

前言

基于反式环辛烯(TCO)和四嗪(Tz)之间的快速和生物正交逆电子需求Diels-Alder点击反应的体内预靶向方法如下所示。该方法包括四个步骤：1)施用单克隆抗体(mAb)-TCO免疫偶联物;2)抗体在肿瘤处积聚并从血液中清除;3) 注射小分子Tz基放射性配体;4)两个组分之间的体内点击连接，然后快速清除任何多余的放射性配体。

材料和方法(概述)

MeCOSar-Tz 的合成

MeCOSar-NHS、苄氨基四嗪盐酸盐和二异丙基乙胺在1ml二甲基甲酰胺中进行，60℃避光下搅拌反应1h。产物MeCOSar-Tz通过反相高效液相色谱 (HPLC)纯化。HPLC-电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析产物馏分，冻干得到粉红色粉末。

MeCOSar-Tz 的放射性标记

使用乙酸铵缓冲液稀释0.05M HCl中的[64Cu]CuCl2储存液和0.01 M HCl的[67Cu]CuCl2的储备液。添加MeCOSar-Tz，将标记溶液在搅拌温度混合器上以500 × g在37°C下孵育20分钟。通过即时薄层色谱(iTLC)评估放射性标记反应，其显示放射化学纯度> 99%。因此不需要进一步纯化。

肿瘤模型

所有体内研究均在雌性无胸腺裸鼠中进行。小鼠在右侧皮下进行异种移植，5 × 10^6的SW1222 细胞悬浮在150 µL 溶液中(1:1 的基质胶和细胞培养基)。肿瘤在~14天后达到理想的实验尺寸(~100 mm)。

体外生物分布实验

对于预靶向生物分布实验，在静脉内施用 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz(9.5 至 11.0 MBq，0.7 至 0.8 nmol)前24或72h，通过侧尾静脉向小鼠注射 huA33-TCO(100 µg、0.7 nmol、5 TCO/mAb)。相比之下，对照组小鼠仅接受 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(9.3 至 10.0 MBq，0.7 nmol)。在注射 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz后4、24、48和 72 h处死小鼠，收集它们的器官并称重，使用校准67 Cu的伽马计数器测定放射性。

在直接放射性标记的 huA33 的生物分布实验中，[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(1.9 MBq, 100 µg, 0.7 nmol)通过尾静脉注射给药。在注射后 4、24、72 和120 h，处死小鼠，收集它们的器官并称重，使用校准67 Cu的伽马计数器测定放射性。

剂量学计算

将每个时间点的五个组织样本的平均活性浓度拟合到双指数函数以创建时间-活性曲线(TAC)。对于大多数组织，最佳TAC拟合使用一室或二室模型。肿瘤在实验过程中表现出显着的吸收，因此，梯形模型一直使用到最后一个时间点，之后假设放射性清除完全由放射性衰变决定。从时间-活动曲线下的面积计算每个组织中的累积摄取。

纵向放射治疗研究

在纵向放射治疗研究中，使用了三个对照队列、四个 PRIT 队列、一个治疗诊断 PRIT 队列和一个传统 RIT 队列(n = 10)。第一个对照组仅接受生理盐水，第二组仅接受 huA33-TCO(100 µg，0.7 nmol，5 TCO/mAb)，第三组仅接受 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(55.5 MBq，0.7 nmol)。注射日被指定为实验的“第0天”。

根据huA33-TCO和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz预靶向的生物分布数据，选择72h注射间隔进行纵向治疗研究，因为它在血液中产生较低的活性浓度。PRIT队列中的所有动物都接受了huA33-TCO(100 µg，0.7 nmol，5 TCO/mAb)，72 h后注射了[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(18.5、37、55.5 或 27.8 MBq)，0.7 nmol，第 0 天)。为了探索分次给药的功效，接受 27.8 MBq 的组在 48 h后给予第二剂27.8 MBq (0.7 nmol)。在注射后4、24、48 和 96 h进行SPECT成像。

在治疗诊断 PRIT 队列中，在72 h时间点给小鼠施用 [64Cu]Cu-MeCOSar-Tz(10.4至11.3 MBq，0.7 nmol，第 0 天)，然后在24 h后施用[67Cu]Cu- MeCOSar-Tz (55.5 MBq, 0.7 nmol)。在注射 [ 64Cu]Cu-MeCOSar-Tz后 4、24 和 48 h进行 PET 成像。使用64Cu标记的放射性配体给药后48 h采集的PET图像断层确定每个肿瘤内的活性，然后与肿瘤生长速率进行比较。在 [ 67Cu]Cu-MeCOSar-Tz注射后 4、24、48 和96 h进行SPECT成像。在RIT队列中，小鼠被给予[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(18.5 MBq，100 µg，0.7 nmol，第0天)，并在注射后 4、24、48和96 h进行SPECT成像。

使用Peira TM900设备每周两次监测异种移植物的体积。在整个研究过程中，每两周评估一次所有小鼠的毒性迹象，包括嗜睡、食欲不振和体重下降。定义了五个可能的研究终点：1)如果肿瘤的最长尺寸达到 1 厘米;2)如果肿瘤开始阻碍小鼠的运动;3)肿瘤是否坏死;4)如果小鼠体重减轻超过 10%;或5)200 天后。每周从侧尾静脉收集血样，并用 HemaVet 950(Drew Scientific)进行分析。测量了20个血液学参数，包括白细胞计数和血小板计数。

统计分析

所有数据均报告为平均值 ± 标准差。使用GraphPad Prism 7.0 软件进行显着性分析。未配对的双尾t检验、多重t检验或对数秩 Mantel-Cox 检验被采用。

结果

生物共轭、合成和放射化学

huA33-TCO 根据公布的程序通过带有NHS的 TCO 变体与亲本抗体的反应合成，最终产生具有 5.2 ± 0.1 TCO/mAb 标记度和免疫反应性的免疫偶联物88.9 ± 1.8%。进行尺寸排阻-HPLC 以验证 huA33-TCO 的纯度，并确认在生物偶联过程中没有发生明显的聚集。对于放射性配体，我们将 Tz 与 MeCOSar 配对，分离的收率约为 38%。[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz 放射化学纯度 > 99%，摩尔活性为 15.3 至 16.5 GBq/μmol，而[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz放射化学纯度 >99%，摩尔活性为 74.1 至 82.3 GBq/μmol。在本研究中进行的所有体内预靶向实验中，放射性配体的摩尔活性进行了调整，以确保每次注射含有0.7 nmol的Tz，可以显示出更好的体内结果。最后，合成了[67Cu]Cu-MeCOSar-huA33，为生物分布和纵向治疗实验提供直接放射性标记的抗体对照。[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 与huA33-TCO在37 °C下反应0.5 h。

体外生物分布

首先确定PRIT与 huA33-TCO和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz单独结合的疗效。这个过程开始于预靶向生物分布实验，旨在探索[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，确定注射免疫偶联物和放射性配体的最佳间隔时间，便于计算对肿瘤和健康器官的辐射剂量率。为此，给带有scA33抗原表达SW1222人结肠直肠癌异种移植物的无胸腺裸鼠施用huA33-TCO，然后在24或72 h的间隔后施用[67Cu]Cu-MeCOSar -Tz。此外，进行了实验的对照组，其中荷瘤小鼠单独施用相同剂量的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz。在 4、24、48 和72 h后，处死并收获肿瘤以及选定的器官，清洗，干燥，并在伽马计数器上测定)。

在没有 huA33-TCO 的情况下，[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz迅速从血液和健康器官中清除，通过尿液排出，产生的肿瘤摄取可忽略不计(即72 h时为0.2 ± 0.1% ID/g注射后 [hpi])。相反，在用 huA33-TCO和 [67 Cu] Cu-MeCOSar-Tz处理的小鼠中观察到肿瘤中的高活性浓度，在 72 h时的值达到 10.2 ± 2.1%ID/g(24 h间隔)和 9.2 ± 1.3%ID/g(72 h间隔) 在这些相同的小鼠中，残留活性浓度在整个实验过程中，血液中的摄取量下降，从4 h时的3至4%-ID/g开始，到120 hpi时达到0.5至1.0% ID/g。在整个研究过程中，其他组织的摄取量保持相对较低，肝脏是摄取量最高的健康器官(~1至3% ID/g)。总之，这些数字产生了高肿瘤与健康器官活动浓度比，例如，注射间隔为72 h的队列在120 hpi时，肿瘤与血液、肌肉、肝脏和大肠的比率分别为 20.2 ± 7.7、159.2 ± 35.6、6.0 ± 1.6和66.8 ± 37.7。

剂量学

从生物分布数据计算两个预靶向间隔的辐射剂量率和治疗指数。此外，使用直接标记的 [67Cu]Cu-huA33 进行了生物分布实验，并用于剂量学计算。正如预期的那样，与直接放射性标记的抗体相比，两种预靶向方法都降低了辐射剂量率。例如，间隔 72 h的预靶向策略对血液和肝脏产生的剂量率分别为5.9和14.2 cGy/MBq，而[67Cu]Cu-huA33 对相同器官产生72.3和111.5 cGy/MBq 的剂量率。然而，与接受直接标记抗体的队列(574.5 cGy/MBq )表示所有三种方法的治疗指数(肿瘤的辐射剂量率与对特定健康组织的辐射剂量率之比)处于相似的范围内。也就是说，虽然以 24 h间隔进行预靶向产生的肿瘤对血液治疗指数低于直接标记的抗体，但以 72 h间隔的预靶向策略产生最高治疗指数。最后，鉴于其较高的肿瘤对血液治疗指数，选择72h PRIT策略进行纵向治疗研究。

纵向放射治疗

进行了纵向放射治疗研究以询问这种PRIT方法的有效性和安全性。这些实验最初使用了八组携带sc SW1222人类结肠直肠癌小鼠。三个 PRIT 队列接受 huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，72 h后接受三种不同剂量的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz：18.5、37.0或55.5 MBq(每种情况下，0.7 nmol)。相比之下，三个对照组仅接受载体(0.9% 无菌盐水)、单独的 huA33-TCO 或单独的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz (55.5 MBq)。为了探究分次给药的价值，第七组接受了 huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，然后在72 h后接受了两次 27.8 MBq剂量的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，间隔48h。最后，第八个“传统 RIT”队列接受了单剂量的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(18.5 MBq)。

对照组小鼠的肿瘤生长在整个研究过程中没有减弱，而PRIT组和RIT组小鼠的肿瘤表现出较短的生长初期，随后体积急剧减小。放疗组中的所有小鼠最终都达到了异种移植物比第 0 天时小。在三个单剂量 PRIT 组中观察到剂量依赖性治疗反应，接受了55.5 MBq的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz表现出最显着的再生长延迟。在接受18.5 MBq常规放射免疫的 [ 67 Cu]Cu-huA33的小鼠中发现了类似的再生延迟。最后，接受分级 PRIT 的小鼠的反应在很大程度上反映了 55.5 MBq PRIT 组的反应。

使用 Kaplan-Meier 图可以最清楚地显示每种治疗方案的疗效。对照组的中位生存时间为 21 天(生理盐水组)、21 天(仅huA33-TCO)和 31.5 天(仅 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz)。这些值与接受治疗的队列的中位生存时间形成鲜明对比：68.5 天(单剂量 PRIT，18.5 MBq)、98.5 天(单剂量 PRIT，37.0 MBq)、200 天(单剂量 PRIT， 55.5 MBq)、189 天(分次剂量 PRIT)和 200 天(RIT)。数据的统计分析证实了在对照组和所有放射治疗组之间以及在 18.5 和 37.0 MBq PRIT 组和其余三个实验组之间存在显着差异(P值 < 0.01)。然而，在55.5 MBq PRIT、分段 PRIT和传统RIT队列的生存率之间不存在统计学上的显着差异。虽然在研究期间杀死的绝大多数小鼠的肿瘤超过了最大允许大小，但由于其他病理，少数动物不得不被杀死或被发现死亡。根据剂量测定数据、体重测量和血液分析，这些事件不太可能源于放射内治疗本身，而是与免疫功能低下的小鼠的衰老有关。

SPECT 成像

除了具有治疗作用的 141 keV β粒子外，67Cu还发射185 keV(49%) 和93 keV (16%)的伽马射线，这些伽马射线适用于SPECT成像。为了探索利用这些射线来可视化Cu-67疗法的可能性，在放射性给药后 4、24、48 和 96 h对每个队列进行了SPECT成像。在接受分段剂量 PRIT 的小鼠中，在 48 h SPECT 扫描后给予第二剂 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，并在4 h(第一次剂量后52 h)和 48 h(第一次给药后 96 h)再次对小鼠进行成像。总而言之，这些图像说明了几个趋势。第一， [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 通过泌尿道排泄，在 4 hpi采集的图像中清晰可见。其次，在所有队列中，肿瘤是24 h后活性浓度最高的组织。第三，在第二次给药后，接受分段 PRIT 的队列中的肿瘤活性浓度增加，强调了这种方法的可行性。最后，正如预期的那样，与PRIT组相比，直接标记[67Cu]Cu-huA33的组在肝脏中表现出升高的活性浓度。

体重和血液分析

为了评估这种方法的潜在毒性，每周测量每只动物的体重两次。所有的小鼠——除了对照组中只接受 huA33-TCO 的小鼠——在整个研究过程中都保持了可接受的体重(> 原始体重的 90%)。在前2周内，仅55.5 MBq PRIT[ 67Cu]Cu-MeCOSar-Tz、分次剂量PRIT 和RIT组群中观察到小鼠体重略有下降，但这种趋势在不久之后便自我纠正。然而，一般而言，任何放射治疗组的平均体重减轻不超过5%，这表明这种方法在测试的最高剂量下具有良好的耐受性。

除了监测动物的体重外，每周对来自每个队列的代表性小鼠的血液进行分析。在所有接受67Cu的队列中，白细胞(WBC)计数最初都下降了，尽管这些值在实验过程中恢复了。在 55.5 MBq 单剂量 PRIT 队列中观察到最大的下降。有趣的是，当 55.5 MBq 的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz作为分次给药(间隔 2 天的两次 27.8 MBq 的剂量)时，WBC 计数的下降幅度较小(第 7 天P = 0.01)。毫不奇怪，与接受相同剂量放射性(18.5 MBq)的 PRIT 队列相比，RIT 队列的 WBC 计数下降幅度更大，恢复也更缓慢。所有接受67 Cu 的队列的血小板计数同样下降，但最显着的下降发生在 55.5 MBq PRIT 队列中。此外，与接受等剂量 PRIT 的组相比，在接受 RIT 的队列中再次观察到血小板计数显着下降(第 14 天P = 0.001)。然而，与WBC 计数一样，降低的血小板计数值在研究的前3周在所有队列中恢复。

将治疗诊断 PET 成像融入67 Cu-PRIT

研究的最后一步是对 PRIT 的双同位素方法进行体内评估，该方法结合了64 Cu PET 成像和67 Cu 放射治疗。为此，进行了一项纵向治疗实验，其中给携带 sc A33 抗原表达 SW1222 的无胸腺裸鼠注射 3 次：huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，然后在 72 h后注射 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar -Tz(10.4 到 11.3 MBq，0.7 nmol)，24 h后注射[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz(55.5 MBq，0.7 nmol)。从治疗的角度来看，这种方法产生的平均生存期 > 200 天，肿瘤生长停滞与三种最有效的治疗策略相当：55.5-MBq PRIT、分割 PRIT 和 RIT。在施用64 Cu 标记的放射性配体后 4、24 和 48 h收集的 PET 图像反映了我们之前的发现，即肿瘤组织在早期时间点清晰可见，并且在 24 和 48 h时成为最突出的特征。毫不奇怪，在 48 h收集的 PET 图像显示肿瘤摄取 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz的异质性，异种移植物中心的放射性水平范围为 3.0 至 12.6 kBq。重要的是，个体小鼠的治疗反应似乎与肿瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz的摄取水平相关。也就是说，经历肿瘤再生的四只小鼠是肿瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz摄取量最低的四只小鼠：3.0、4.1、5.6和6.8 kBq。相比之下，肿瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 水平较高的六只小鼠(均>9.0 kBq)表现出完全的肿瘤缓解。最后，从[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz获得的 SPECT 图像与 PET 图像非常相似，增强了后者的治疗诊断价值。

讨论

长期以来免疫放射偶联一直有望用于内照射治疗，但对健康组织的高辐射剂量率阻碍了其广泛临床使用。近年来，治疗诊断成像帮助临床医生选择 RIT 患者并优化放射免疫偶联物的剂量，以最大限度地提高其安全性和有效性。而且，虽然显像剂的出现推动了该领域的发展，但它并没有消除放射性标记抗体的内在问题。

这项研究的首要目标是创建一种预靶向的放射内治疗方法，能够利用抗体和治疗诊断成像的优势，同时避开全长免疫球蛋白的药代动力学及剂量学的限制。该策略基于携带 TCO 的免疫偶联物和含有 Tz 的放射性配体之间的快速生物正交逆电子需求 Diels-Alder 连接。基于该策略已在小鼠模型中验证了有关18F, 68Ga, 177Lu, and 225Ac的标记和不同的抗体。最近，将该预靶向策略这些演示中的每一个都只关注一种模式：PET 或 PRIT。

当我们将注意力转移到预靶向的治疗诊断方法上时，很明显，我们需要使用发射适合成像和治疗的单个放射性核素或一对放射性核素。鉴于前者少之又少，我们转向使用放射性核素对。沿着这些思路，我们证明了使用64 Cu 和177 Lu 标记的四嗪进行双同位素预靶向的可行性：[ 64 Cu]Cu-SarAr-Tz和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG 7 -Tz。毫无疑问，这项工作的一个最重要的发现是注射第一种放射性配体不会对第二种放射性配体的肿瘤摄取或整体生物分布产生不利影响。也就是说，在使用 huA33-TCO 和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG 7 -Tz 给药之间的 48 h间隔的预靶向实验中，在相同条件下在肿瘤中观察到在 4、24 和 48 h活性浓度为 5.2 ± 1.2、9.0 ± 2.6 和 13.0 ± 2.8% ID /g，但在免疫偶联物后一天和177 Lu 标记的放射性配体前一天注射 [ 64 Cu]Cu-SarAr-Tz和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz的肿瘤活性浓度几乎相同：在相同时间点为4.9 ± 0.4、11.3 ± 1.6 和 13.1 ± 2.7% ID/g。这种现象在治疗诊断学的背景下至关重要，因为它确保用于成像的放射性配体不会减弱用于治疗的放射性配体的摄取或功效。然而，从治疗诊断的角度来看，这种基于64 Cu/ 177 Lu的策略最终不是最理想的，因为这两种放射性配体是不同的，因此会表现出不同的药代动力学特征和体内行为。此外，使用177 Lu( t 1/2∼ 6.7 d) 未能利用体内预靶向的一个重要方面：使用具有通常与抗体不相容的半衰期的放射性核素的能力。

在这项工作中，针对这些问题，我们使用了铜的两种放射性同位素——发射正电子的64 Cu 和发射 β 粒子的67 Cu——来产生一对化学上相同的放射性配体：[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz和[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz。使用作为同位素体的放射性配体有两个主要优点。首先，两种放射性配体的体内行为将相同，便于使用前者作为后者生物分布的预测因子。其次，仅使用一种化学物质作为放射性配体(Cu-MeCOSar-Tz)将简化毒理学测试并简化整个监管审查过程。

使用 huA33-TCO 和 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 进行预靶向的生物分布数据呈现出相对较少的惊喜。放射性配体的肿瘤摄取甚至在最早的时间点就很明显，并且在整个实验过程中都在增长，这表明67 Cu 标记的四嗪正在与肿瘤结合的 huA33-TCO 和随后在异种移植物中积累的循环免疫偶联物发生反应。[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz相对较快地从血液和健康器官中清除，最终全面产生有希望的肿瘤与健康器官活性浓度比。从剂量学的角度来看，与直接放射性标记的67 Cu-huA33相比，64Cu-PRIT 策略可显着降低个体器官剂量率。67Cu-PRIT 与177Lu 标记的 huA33进行比较时，也可以看到辐射剂量的减少。这可以说是更现实的比较，因为67 Cu 很少用于标记临床的全长 IgG。也就是说， 67 Cu-PRIT对血液的辐射剂量率估计为5.9 cGy/MBq，而67 Cu-huA33为 71.3 cGy/MBq， 177 Lu-huA33为 67.7 cGy/MBq。然而，与直接标记的67 Cu-huA33 和177 Lu-huA33相比， 67 Cu-PRIT对肿瘤产生的辐射剂量也较低。因此，大多数器官的预靶向治疗指数通常与传统放射免疫偶联物的治疗指数相当，而67 Cu-PRIT 的关键肿瘤-血液治疗指数(9.7，间隔 72 h)仅略高一些，高于67 Cu-huA33(8.1)，但仍低于177Lu A33(18.6)。这是未来可以改进的领域。例如，优化方法的时间安排和每种成分的剂量可以通过增加对肿瘤的剂量率和/或降低对健康器官的剂量率来改善治疗指数。此外，我们的实验室和其他人还探索了使用清除剂作为降低血液和健康器官中活动浓度的一种手段;然而，清除剂虽然有效，但不可避免地会给已经很复杂的系统增加另一个复杂因素。

纵向治疗研究提供了一个平台来比较各种治疗策略的疗效。最重要的是，与所有对照组相比，所有放疗组在平均生存时间方面都表现出统计学上的显着差异。此外，在低、中和高剂量PRIT队列中观察到具有统计学意义的剂量依赖性反应。有趣的是，虽然在 55.5 MBq PRIT(200 天)和分级 PRIT(189 天)组的中位生存时间之间没有观察到统计学上的显着差异，但后者的四只小鼠在实验过程中肿瘤再生，而前者仅有一个。这一现象可能是由于分级剂量队列直到给药后120小时才接受第二次27.8 MBq剂量(使总剂量达到55.5 MBq)，这可能降低了肿瘤的总辐射剂量。尽管如此，分级 PRIT 队列的 SPECT 成像结果清楚地表明，放射配体的第二次给药增加了肿瘤中的活性浓度，这表明如果进一步优化，分级给药可能是一种可行的方法。55.5 MBq PRIT 队列的平均生存时间也与接受 18.5 MBq [67 Cu]Cu-huA33相匹配。 然而，RIT 队列的表现确实优于接受相同 18.5 MBq 剂量的 PRIT 队列，鉴于 RIT 对肿瘤组织的剂量率较高，这一结果并不令人惊讶。值得注意的是，RIT 和 PRIT 在 37.0和 55.5 MBq 水平上没有进行等剂量比较，因为文献表明这些剂量的67Cu标记抗体会在小鼠中引起急性辐射毒性。最后，体重监测和血液分析通常表明所有放射治疗策略都具有良好的耐受性，尽管在接受较高辐射剂量的小鼠队列中观察到体重、WBC 计数和血小板计数轻微但暂时的下降。

尽管67Cu-PRIT本身就具有前景，但该研究最令人兴奋的结果可能来自于采用我们的PRIT治疗方法的实验。在纵向治疗研究中，接受治疗诊断64/67 Cu-PRIT 的队列的平均存活时间 > 200 天，与接受 55.5-MBq PRIT 和 18.5-MBq RIT 治疗的组相同。也就是说，与接受相同剂量 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-的单剂量 PRIT 组中仅一只肿瘤再生相比，治疗诊断 PRIT 组中的四只小鼠表现出肿瘤再生。根据我们之前的发现，一种放射性配体的给药不会阻碍第二种放射性配体的吸收，这种现象不太可能与治疗诊断队列中使用两次注射有关。一个更可能的解释可能在于肿瘤的异质性，或者更有可能的是，单剂量 PRIT 队列中的小鼠在注射 huA33-TCO 后 72 h接受了 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 而那些在治疗组收到67免疫偶联物给药后 96 h铜标记的放射性配体。然而，最关键的发现是，PET 成像结果可以让我们预测哪些小鼠会经历肿瘤再生。在 48 h PET 扫描(3.0、4.1、5.6 和 6.8 kBq)中，肿瘤中放射性水平最低的四只小鼠是肿瘤再生的小鼠。相比之下，该队列中的所有其他成员——其异种移植物含有 > 9.0 kBq 的 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz——都经历了肿瘤组织的完全和持久的收缩。最后，虽然我们之前的工作确定了双放射性核素预靶向的可行性，但这项研究进一步推进了两个关键步骤：证明了67Cu-PRIT 并说明了预靶向64 Cu-PET 作为对67 Cu-PRIT 响应的预测指标的有用性。

这项调查的数据为将治疗诊断 PET 成像纳入 PRIT 方案制定了清晰的路线图。随着预靶向 PET 越来越接近临床——预计 2021 年初来自胰腺癌患者的第一张图像——人们可以很容易地想象未来如何将预靶向成像和治疗结合起来：在收集初始 PET 扫描后，医生可以决定患者是否适合 PRIT。如果肿瘤标准摄取值 (SUV) 高于预定阈值，则患者将接受一剂治疗性 Tz 放射性配体。另一方面，如果 PET 扫描显示摄取不足，临床医生将转向并寻求其他治疗选择。